Klon-Bibliotheken und Pooling

Ziel des Humangenomprojektes ist die Entschlüsselung des menschlichen Erbgutes. Ein wichtiger Zwischenschritt ist dabei die Erstellung physikalischer Kartierungen. Um die sehr langen chromosomalen DNA-Moleküle analysieren und sequenzieren - also die Abfolge der Basen A, C, G und T bestimmen - zu können, ist es nötig, eine ausreichende Menge einheitlichen Materials zu gewinnen. Dazu wird die DNA in kleinere Fragmente zerlegt. Chromosomen oder komplette Genome werden mit Restriktionsenzymen in mehrere zehn- oder hunderttausende, einander überlappende Bruchstücke unterteilt. Die Sammlungen solcher Bruchstücke werden als Bibliotheken bezeichnet.

**Abbildung 4.8:** *Das Ergebnis einer PCR-Reaktion wird durch Gel-Elektrophorese sichtbar gemacht. Die hellen Stellen sind genomische DNA.*
$\begin{figure}\begin{center} \epsfxsize =\linewidth \epsfbox{bioinfo/gel1.ps}\end{center}\end{figure}$

Einzelne Fragmente werden jeweils z.B. in künstliche Hefechromosomen (YACs, yeast artificial chromosomes) eingebaut, damit man sie vermehren (klonen) kann. Das Zerteilen mit Restriktionsenzymen stellt sich bei unbekannter Sequenz als nicht deterministisch dar: Die Lage der Schnittstellen ist unbekannt. Darüberhinaus ist es nicht sicher, dass an allen möglichen Schnittstellen geschnitten wird. Daher muss, um sicherzustellen, dass die gesamte DNA in der Bibliothek enthalten ist, jede Position in mehreren Klonen enthalten sein. Diese Überdeckungstiefe nennt man Coverage. Typisch sind Werte zwischen 3 und 24.

Nach dem Zerschneiden hat man keine Information über die Lage der in einem Klon enthaltenen DNA in Bezug auf das Genom. Diese muss anhand der Überlappungen der Klone rekonstruiert werden. Hierzu werden sogenannte Sequence-Tagged-Sites (STS) Marker benutzt. Alle Klone, die denselben STS-Marker enthalten, müssen sich überlappen. Zur Überprüfung muss für jede STS und für jeden Klon eine geeignete Polymerase-Chain-Reaction (PCR) vorgenommen werden. Bei der großen Anzahl an Klonen und zu testenden STSs bieten sich hier Gruppentests an, um den experimentellen Aufwand zu begrenzen.

Um für alle STSs nur einmalig die Pools erstellen zu müssen und damit experimentelle Fehler zu minimieren, haben wir uns für eine nicht-adaptive Poolingstrategie entschieden. Die größte bisher gepoolte Klon-Bibliothek hat 442.368 Klone bei 94 Pools. Hierbei befindet sich jeder Klon in 8 Pools, und jeder der Pools enthält ca. 4.600 Klone.